Prins Nikolai is geboren op 28 augustus 1999 in Kopenhagen als zoon van prins Joachim en Alexandra Christina Manley. Nikolai heeft een broer, prins Felix (2002), een halfbroer, prins Henrik (2009) en een halfzus, prinses Athena (2012). 

Prins Nikolai is gedoopt op 6 november 1999 in de kapel van Fredensborg Paleis. Zijn peetouders zijn zijn oom kroonprins Frederik, prins Edward van Groot-Brittannië, Peter Steentrup, zijn tante Nicola Baird en Camilla Flint.